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简述大鼠肝微粒体的制备方法

发表时间:2022-09-01  |  点击率:197
  肝脏是药物的主要代谢器官,富含参与药物的一相代谢和二相代谢的混合功能氧化酶系统,其中90%药物主要是由细胞色素P450酶参与进行生物转化。采用从肝脏或肠提取的微粒体,加入还原型辅酶Ⅱ(NADPH)再生系统,在体外模拟生理环境下进行代谢反应,采用高效液相色谱质谱联用法等测定方法对原性药及代谢产物进行测定,其中肝微粒体法较为常见。
 
  大鼠肝微粒体是肝、肠、肾等器官经过差速离心制备的亚细胞成分,是细胞器内质网一部分,该部分表达有种类多样的蛋白质。具有完整的I相代谢酶(如细胞色素P450、黄素单加氧酶、单胺氧化酶等),II相代谢酶(如葡萄糖醛酸转移酶,硫酸基转移酶)、酯酶等,能体现绝大部分人体内药物代谢的情况,是FDA指导原则的预测人体内代谢及抑制试验的研究工具。
 
  下面小编要与大家分享的是大鼠肝微粒体的制备方法:
 
  1、购买实验动物SD大鼠,20只,雌雄各半,体重(180-220)g。
 
  2、大鼠肝脏灌流,购买的大鼠当天腹腔注射3%(30mg?kg-1),使其麻醉,利用酒精进行常规消毒后,打开腹腔暴露肝脏,肝门静脉处进行插管并固定。结扎上腔静脉,剪破下腔静脉用磷酸盐缓冲液进行灌流,直至肝脏颜色呈土黄色。
 
  3、灌流好的肝脏取出后按1:4比例放入装有磷酸盐缓冲液(含1mMEDTA,0.25M蔗糖)的匀浆管内,剪碎、匀浆。
 
  4、将匀浆液倒入50mL高速离心管中在4℃条件下9000g离心20min。
 
  5、保留上清并转移到超速离心管中,在4℃条件下100000g离心60min。
 
  6、保留沉淀并重新混悬于磷酸盐缓冲液(含0.9%的NaCL)中,4℃条件下100000g再离心60min,得到的沉淀即为肝微粒体。
 
  7、将其重悬于0.1M磷酸缓冲液(PH7.4,20%甘油,1mMEDTA,0.25M蔗糖)中于-70℃冰箱保存,其中留取一小管用于蛋白浓度测定。