人乳腺成纤维细胞试剂盒是肿瘤研究与药物筛选的重要工具

　　第一步：准备工作与环境消毒

　　在生物安全柜内操作，提前开启紫外灯照射30分钟。实验人员需穿戴无菌手套、实验服与口罩。将水浴锅预热至37℃，CO2培养箱设定为37℃、5%CO2、饱和湿度。检查试剂盒内各组分是否齐全、未过期。

　　第二步：细胞复苏与接种

　　从液氮罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴中快速摇晃融化（1-2分钟），避免冰晶缓慢解冻损伤细胞。用75%酒精消毒管壁，转入生物安全柜。将细胞悬液缓慢转移至含5-10mL预热培养基的离心管中，1000rpm离心5分钟，弃上清。用新培养基重悬细胞，接种于预先包被的T25或T75培养瓶中，轻轻混匀后放入培养箱。

　　第三步：培养基配制与更换

　　试剂盒通常提供基础培养基与专用添加剂（如生长因子、血清、抗生素）。按说明书比例无菌混合，配制成培养基，4℃避光保存，建议2周内用完。细胞贴壁后（约24小时），换液去除残留DMSO；此后每2-3天更换一次培养基，观察细胞形态与密度。

　　第四步：细胞传代与扩增

　　当细胞融合度达80%-90%时进行传代。弃培养基，用无菌PBS轻柔洗涤一次。加入适量胰酶-EDTA溶液，37℃孵育1-3分钟，显微镜下观察细胞变圆、脱落。加入含血清培养基终止消化，吹打均匀，按1:2至1:4比例传代至新培养瓶。

　　第五步：细胞冻存与长期保存

　　选取对数生长期细胞，按上述方法消化、离心。用细胞冻存液（含90%培养基+10%DMSO）重悬，按1mL/管分装至冻存管。采用程序降温盒（-1℃/min）或梯度降温法，于-80℃过夜后转入液氮长期保存。

　　第六步：质量监控与污染防范

　　每日观察细胞形态（应呈长梭形、成纤维细胞典型特征）、生长状态及有无微生物污染（浑浊、pH变化）。定期检测细胞活力（台盼蓝染色）与支原体污染。