掌握鼠尾胶原蛋白制备方法是保障实验可重复性与生物学功能的关键

更新时间：2025-12-02

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　　鼠尾胶原蛋白是从大鼠尾腱中提取的高纯度天然胶原，因其结构完整、生物相容性优异，被广泛应用于3D细胞培养、组织工程支架、伤口修复模型及药物递送系统等前沿研究。其制备过程对温度、pH、离子强度及操作洁净度敏感，稍有偏差即导致变性、降解或凝胶性能异常。掌握鼠尾胶原蛋白标准化、无菌化的制备方法，是保障实验可重复性与生物学功能的关键。

　　一、材料与前期准备

　　实验动物：选用健康成年SD或Wistar大鼠（6–12周龄），尾部无损伤；

　　试剂：0.1%醋酸溶液（用超纯水配制，4℃预冷）、PBS缓冲液、75%乙醇；

　　器具：无菌手术剪/镊、玻璃匀浆器、离心管、磁力搅拌器、低温离心机（4℃）、0.22μm滤器；

　　环境：全程在超净工作台内操作，所有器具经高温高压灭菌。

　　二、尾腱分离与清洗

　　处死大鼠后迅速取下整条尾巴，浸入75%乙醇消毒30秒；

　　在冰上剥离皮肤，逐节剪断尾椎骨，小心分离白色尾腱束；

　　将尾腱置于预冷PBS中反复漂洗，去除血迹与脂肪组织。

　　三、酸溶提取（关键步骤）

　　将洗净的尾腱剪碎（约1–2mm段），按1g组织:50mL比例加入0.1%冰醋酸溶液；

　　4℃磁力搅拌24–48小时（避光），使胶原充分溶出；

　　注意：全程保持低温，防止酶解或热变性；避免剧烈震荡产生气泡导致蛋白氧化。

　　四、离心与过滤纯化

　　4℃下以10,000–12,000×g离心30分钟，弃沉淀；

　　上清液经0.22μm滤膜过滤除菌，得澄清淡黄色胶原溶液；

　　可分装于无菌EP管，–20℃或–80℃保存（避免反复冻融）。

　　五、浓度测定与质量验证

　　羟脯氨酸法或BCA法测定蛋白浓度（通常为1–3mg/mL）；

　　SDS-PAGE电泳验证α1、α2链完整性（典型条带约130kDa和120kDa）；

　　凝胶形成测试：将胶原液调至中性（加10×PBS和NaOH），37℃孵育30分钟，应形成均匀凝胶。