代谢π析（七） 不止Ames：双诱导仓鼠肝S9在药物杂质评估中的多元应用场景

导读

在前几期「代谢π析」中，我们系统探讨了双诱导仓鼠肝S9在亚硝胺类杂质遗传毒性评估中的核心价值，以及NDMA、NDEA等阳性对照的选择策略[13] 。

然而，Ames试验只是仓鼠S9应用版图中的一角。在药物杂质安全性评估的完整体系中，还有多个关键试验需要代谢活化系统的支持——从检测基因突变的小鼠淋巴瘤试验（MLA），到评估染色体损伤的体外染色体畸变试验和微核试验，再到检测DNA链断裂的彗星实验（Comet Assay）[1, 7, 8]，仓鼠S9正在这些领域展现出独特的价值。

（图1：遗传毒性评估多元试验体系示意图（5个试验））

本期，我们将带您全面了解双诱导仓鼠肝S9在更多药物杂质评估场景中的应用，并探讨“加强版"遗传毒性评估体系的构建策略。

一、为什么“加强版"需要多元试验体系？

药物杂质的遗传毒性评估，不能仅依赖单一试验。根据ICH M7(R2）指南，致突变杂质的评估需要综合细菌回复突变试验（Ames）和哺乳动物细胞试验的数据 。

不同试验类型检测的遗传损伤终点不同，对代谢活化的需求也存在差异（详见表1）：

（表1：五大遗传毒性试验对比表）

划重点：对于前致突变物（如亚硝胺类），如果在Ames试验中仅使用大鼠S9可能漏检，那么在其他哺乳动物细胞试验中，同样需要更高效的代谢活化系统。这正是双诱导仓鼠肝S9的价值所在[7, 8, 9, 14, 15]。

二、仓鼠S9在小鼠淋巴瘤试验（MLA）中的应用

2.1 MLA：检测基因突变的“哺乳动物视角"

小鼠淋巴瘤试验（Mouse Lymphoma Assay, MLA）是OECD TG 490[12]认可的体外哺乳动物细胞基因突变试验，通过检测L5178Y细胞tk位点的突变频率，评估受试物的致突变性。

与Ames试验使用细菌不同，MLA使用哺乳动物细胞，能够：

· 检测更广泛的突变类型（点突变+染色体断裂）

· 更接近人体细胞的DNA修复和代谢环境

· 为ICH M7的杂质分类提供关键数据

2.2 仓鼠S9在MLA中的价值

研究表明，在MLA中使用仓鼠肝S9作为代谢活化系统，对于某些前致突变物的检测灵敏度显著优于传统大鼠S9方案。

核心优势：

2.3 实操建议：MLA中的仓鼠S9使用参数

（表2：仓鼠S9在MLA试验中的使用参数）

三、仓鼠S9在体外染色体畸变试验中的应用

3.1 染色体畸变试验：检测“看得见"的损伤

体外染色体畸变试验（OECD TG 473）[10]通过显微镜观察中期分裂相细胞的染色体结构和数目异常，检测受试物是否诱导染色体断裂、交换、环状染色体、多倍体等损伤。

这类损伤往往与致癌性直接相关，是遗传毒性评估的重要组成部分。

3.2 仓鼠S9的应用价值

在染色体畸变试验中，代谢活化系统的选择同样关键。

数据支撑：

· 研究显示，使用诱导仓鼠肝S9活化系统与诱导SD大鼠肝S9活化系统的试验结果接近，均可满足体外遗传毒理试验需求

· 对于依赖CYP2E1活化的前致突变物，仓鼠S9体系表现出更高的致突变检出率

3.3 实操建议：染色体畸变试验中的仓鼠S9使用参数[11] 

（表3：仓鼠S9在染色体畸变试验中的使用参数）

四、仓鼠S9在体外微核试验中的应用

4.1 微核试验：检测染色体断裂的“便捷指标"

体外微核试验（OECD TG 487）通过检测细胞质中微核的形成频率，评估受试物的染色体断裂或非整倍体诱导能力。相比染色体畸变试验，微核试验更简便、通量更高。[15]

4.2 仓鼠S9的应用价值

体外微核试验同样认可使用代谢活化系统。仓鼠肝S9因其高CYP酶活性，被推荐用于前致突变物的微核试验评估[6] 。

最新研究进展：

2025年发表的研究显示[11]，使用30%仓鼠肝S9结合TA1535菌株，对亚硝胺类化合物的检测灵敏度高达90%。 虽然该研究针对Ames试验，但代谢活化原理同样适用于微核试验。

4.3 实操建议：微核试验中的仓鼠S9使用参数

（表4：仓鼠S9在微核试验中的使用参数）

五、仓鼠S9在彗星实验（Comet Assay）中的应用

5.1 彗星实验：检测DNA链断裂的“灵敏探针"

彗星实验（Comet Assay，又称单细胞凝胶电泳）是一种在单细胞水平上检测DNA链断裂的灵敏方法。当受试物为前致突变物、需要代谢活化才能产生活性代谢产物时，添加S9代谢活化系统是必要的技术手段。

（ 图2：彗星实验原理及S9代谢活化流程示意图）

检测终点：

· DNA单链断裂

· DNA双链断裂

· 碱性不稳定位点

· 交联损伤（修饰版）

5.2 仓鼠S9在彗星实验中的价值

为什么选择仓鼠S9？

1. 更高的CYP酶活性：Evans等[1]（2025）发表于《Mutation Research》的研究表明，诱导仓鼠S9的CYP2A6样活性较诱导大鼠S9高出约60倍。对于依赖CYP2A6/CYP2E1活化的亚硝胺类化合物，仓鼠S9可显著提高DNA损伤检测灵敏度。

2. 与常用细胞系的种属匹配：彗星实验常用的细胞系包括V79（中国仓鼠肺成纤维细胞）、CHL（中国仓鼠肺细胞）、CHO（中国仓鼠卵巢细胞），均来源于中国仓鼠。使用金黄地鼠（叙利亚仓鼠）肝S9在种属上更接近，具有更好的生物兼容性。

5.3 方法学参数与优化建议

在彗星实验中添加S9代谢活化系统的方法与Ames试验类似，但暴露时间更长[3][4] [5]：

（表5：仓鼠S9在彗星实验中的使用参数）

经典文献支持：Oshida等（2010）在FDC-P2细胞中使用大鼠肝S9（6%，暴露6小时）成功检测环磷酰胺和苯并[a]芘的DNA损伤[4] 。该技术路径同样适用于仓鼠S9。

5.4 应用场景优先级

（表6：仓鼠S9在彗星实验中应用场景优先级）

六、构建“加强版"遗传毒性评估体系

6.1 为什么要“加强"？

传统遗传毒性评估体系（Ames+MLA+微核）对大鼠S9活化体系已经能够检出大多数致突变物。然而，对于亚硝胺类等依赖特定CYP酶活化的前致突变物，传统体系存在漏检风险[1,7,8,9]。

6.2 仓鼠S9在“加强版"体系中的角色定位[13] 

（表7：仓鼠S9在加强版体系中的角色定位）

6.3 从“单一工具"到“代谢活化矩阵"

随着监管要求的升级，药物杂质评估已从“一个S9走天下"演进为“多物种、多浓度、多参数"的代谢活化矩阵。

齐氏生物的建议策略（详见下图）[1, 7, 8, 9, 11]：

（表7：仓鼠S9在加强版体系中的角色定位）

实操总结：

（表8：仓鼠S9在不同试验类型中的使用参数推荐表）

七、案例分享：仓鼠S9在复杂杂质评估中的多元应用

案例1：某ADC药物连接子杂质的全面评估[16]

背景：某ADC药物在连接子合成工艺中发现了1个NDSRI杂质。

评估策略：

· Ames试验：使用30%仓鼠S9 + TA1535，检出阳性

· MLA：使用10%仓鼠S9，确认基因突变风险

· 微核试验：使用10%仓鼠S9，评估染色体断裂风险

· 彗星实验：使用6%仓鼠S9 + V79细胞，确认DNA链断裂损伤

结果：四项试验均呈阳性，杂质被归类为ICH M7 Class 2，需控制在AI限值以下。

案例2：某小分子候选药物的早期筛选[17]

背景：某小分子候选药物结构中含有潜在的警示结构。

评估策略：

· Ames试验：使用30%仓鼠S9 + 10%大鼠S9双体系，确保无漏检

· 彗星实验：使用6%仓鼠S9快速评估DNA损伤潜力

结果：Ames试验阴性，彗星实验阴性，代谢稳定性可接受，项目顺利推进至IND申报。

注：以上案例基于齐氏生物服务客户的项目经验及行业典型实践整理，具体数据已做脱敏处理。

八、齐氏生物：您的一站式遗传毒性评估合作伙伴

作为双诱导金黄地鼠肝S9的专业供应商，齐氏生物为您的遗传毒性评估提供全面支持：

8.1 核心产品线

8.2 技术服务体系

· 试验方案设计支持：协助客户优化S9浓度、预孵育/暴露时间等关键参数

· 方法验证服务：使用阳性对照验证S9批次活性

· NDSRI阳性对照选择咨询：根据杂质结构推荐交叉参照方案

· GLP体系合规支持：产品符合GLP试验需求，已有国内多家GLP安评机构合作案例

8.3 产品优势

结语

双诱导仓鼠肝S9的价值，远不止于Ames试验。

从小鼠淋巴瘤试验（MLA）到染色体畸变试验，从微核试验到彗星实验，仓鼠S9正在构筑药物杂质评估的“代谢活化矩阵"。在亚硝胺类杂质监管日趋严格的今天，拥有一个高效、可靠的代谢活化系统，是确保遗传毒性评估不漏检、合规申报的关键保障。

齐氏生物将继续致力于提供高品质的仓鼠肝S9产品和专业的技术服务，助力您的药物研发项目安全、高效地推进。

本期是「代谢π析·仓鼠S9专题」的第4篇。下一期，我们将继续探讨仓鼠S9在药物代谢动力学研究中的更多应用，敬请期待。

了解更多仓鼠S9产品详情，或获取遗传毒性评估方案支持，欢迎联系齐氏生物。

参考文献

[1] Evans K, Boitnotte S, Zeiger E, Cheung J, Lynch A. A comparative analysis of select P450 enzymes in uninduced and PB/BNF-induced hamster and rat liver S9[J]. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 2025, 902: 503855. DOI: 10.1016/j.mrgentox.2025.503855

[2] Geijer ME, Gernaat AM, Moelijker N, Brandsma I, Hendriks G. An enhanced metabolization protocol for in vitro genotoxicity assessment of N-nitrosamines in mammalian cells[J]. Environmental and Molecular Mutagenesis, 2025. (Wiley, in press)

[3] MutaMind Consortium. Assessment of the genotoxic potential of structurally different nitrosamines in primary rat hepatocytes using the alkaline comet assay[C]. Poster P039, GPTS 2025.

[4] Oshida K, et al. Comet assay in murine bone-marrow cell line (FDC-P2) with rat liver S9 activation[J]. Toxicology in Vitro, 2010, 24(3): 1039-1044.

[5] European Food Safety Authority (EFSA). Technical recommendations to perform the alkaline standard and enzyme-modified comet assay in human biomonitoring studies[R]. 2019.

[6] PB-BNF-induced S9 enhances the micronucleus induction of promutagens[J]. Scite, 2019.

[7] Dieckhoff J, Bringezu F, Simon S. Metabolic activation of short-chain alkyl N-nitrosamines using Aroclor 1254 or phenobarbital/beta-naphthoflavone-induced rat or hamster S9 – A comparative analysis[J]. Toxicology Reports, 2024, 12: 215-223.

[8] Bercu J, et al. HESI GTTC ring trial: Concordance between Ames and rodent carcinogenicity outcomes for N-nitrosamines (NAs) with rat and hamster metabolic conditions[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2025, 161: 105835.

[9] Bringezu F, Simon S. Salmonella typhimurium TA100 and TA1535 and Escherichia coli WP2 uvrA are highly sensitive to detect the mutagenicity of short alkyl-N-nitrosamines in the bacterial reverse mutation test[J]. Toxicology Reports, 2022, 9: 250-255.

[10] OECD. Test No. 473: In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test[S]. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris, 2016.

[11] 染色体畸变试验方案[S]. 2025. (基于OECD 473指南)

[12] OECD. Test No. 490: In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Tests Using the Thymidine Kinase (Tk) Gene[S]. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris, 2016.

[13] European Medicines Agency. Enhanced Ames test conditions for N-nitrosamines; Appendix 3 to Questions and answers for marketing authorisation holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5(3) of Regulation (EC) No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal products (EMA/120337/2024)[S]. 2024.

[14] OECD. Test No. 471: Bacterial Reverse Mutation Test (Ames test)[S]. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris, 2020.

[15] OECD. Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test[S]. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris, 2023.

[16] Bulger PG, Jones MT, Ford JG, et al. Risk assessment and control of N-nitrosamines in antibody-drug conjugates: Part 1 – An industry survey of current practices[J]. 2024. (IQ Consortium collaborative study)

[17]International Council for Harmonisation. ICH M7(R2): Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk[S]. 2023. (警示结构评估与Ames筛查的法规框架)