代谢π析(五)——加强Ames试验中，仓鼠S9对应的亚硝胺类阳性对照如何选择？

引言

在上一期的文章中，我们深入探讨了双诱导仓鼠（金黄地鼠）肝S9在药物毒理学研究中的核心价值，特别是其在亚硝胺类候选化合物遗传毒性评估中的不可替代性。然而，一套高质量的代谢活化系统只是加强Ames试验成功的一半。如何为亚硝胺类化合物选择合适的阳性对照（Positive Control），同样是确保试验结果可靠、合规的关键环节。

本文将系统阐述加强Ames试验（Enhanced Ames Test, EAT）中小分子亚硝胺类阳性对照的选择原则，并提供基于最新研究数据和监管指南的实操建议。

一、为什么亚硝胺类需要“专门的"阳性对照？

在传统的Ames试验中，阳性对照通常选用2-氨基蒽（2-AA）、苯并[a]芘（BAP）等标准致突变物，用于验证S9代谢活化系统的活性。然而，当评估亚硝胺类化合物时，情况发生了变化（详见图1）。

（图1：亚硝胺类阳性对照在加强Ames试验中的作用示意图）

亚硝胺是一类前致突变物（pro-mutagen），需要在肝脏中被CYP450酶系（主要是CYP2E1和CYP2C19）代谢活化后才能产生致突变活性。传统的阳性对照（如2-AA）虽然也能被S9活化，但其代谢途径和酶谱需求与亚硝胺类存在显著差异。使用与受试化合物代谢特征相匹配的阳性对照，才能更准确地验证S9系统对亚硝胺类化合物的代谢活化能力。

EMA在关于亚硝胺杂质的指南中明确指出[7] ，加强Ames试验应包含两个亚硝胺类阳性对照，最好根据待测亚硝胺的预期代谢特征进行选择。这标志着亚硝胺类阳性对照的选择已经从“通用型"转向了“靶向型"。

二、亚硝胺类阳性对照的推荐清单

综合近年来多项关键研究数据（包括FDA优化研究、HESI国际合作环试研究以及2025年发表的综述分析）[1][4]，以下化合物已被确认为适合在加强Ames试验中作为阳性对照使用的亚硝胺类物质。

2.1 核心推荐：NDMA 和 NDEA

NDMA和N-亚硝基二乙胺（NDEA）是短链烷基亚硝胺中较具代表性的两个成员，也是目前在加强Ames试验中使用最为广泛的阳性对照。

一项系统研究对NDMA和NDEA的Ames试验检测参数进行了定性与定量分析，发现两者的致突变性可以在Ames试验中轻松检出，且最敏感的参数组合包括：30分钟预孵育法、水或甲醇作为溶剂、诱导仓鼠肝S9，以及TA100、TA1535和WP2 uvrA(pKM101)菌株。[1]

值得注意的是，NDMA在不同菌株中表现出差异化的反应特征——在WP2 uvrA(pKM101)菌株中活性更高，而NDEA和CPNP则在TA1535和TA100菌株中更为活跃。[2] 因此，建议将NDMA和NDEA作为“菌株覆盖型"阳性对照组合使用，以全面验证不同突变检测系统对亚硝胺类化合物的响应能力。[3]

2.2 扩展推荐：NDPA 和 NDBA

除了NDMA和NDEA之外，研究还发现N-亚硝基二丙胺（NDPA）和N-亚硝基二丁胺（NDBA）也是合适的亚硝胺类阳性对照选项。一项发表于2024年的比较研究明确指出，NDEA、NDPA和NDBA均可作为加强Ames试验中额外的亚硝胺阳性对照使用。[1]

在实际应用中，使用10%诱导大鼠S9或10%诱导/未诱导仓鼠S9即可检测到NDEA、NDPA和NDBA的致突变活性。这为实验室在阳性对照选择上提供了更大的灵活性。

三、阳性对照的选择策略与浓度优化

3.1 基于待测化合物特征的分层选择策略

建议采用以下分层策略来选择阳性对照(详见图2和表3）

（图2：亚硝胺类阳性对照分层选择策略流程图）

（表2：基于待测化合物特征的分层阳性对照选择策略）

3.2 S9浓度对阳性对照响应的影响

S9浓度的选择直接影响阳性对照的响应强度，进而影响试验的有效性判定。多项研究得出一致结论：30%仓鼠S9产生的致突变响应高于10% S9。[1][4]

一项涵盖29种亚硝胺和17种NDSRI的大规模优化研究显示，使用TA1535和WP2 uvrA(pKM101)菌株组合、30分钟预孵育、以及含30%仓鼠肝S9的S9混合液，即可检测到全部18个阳性亚硝胺。[4]

对于NDMA，研究发现使用20%大鼠S9或10%仓鼠S9即可检测到显著突变频率。但需要警惕的是，过高的S9浓度可能对细菌产生细胞毒性，导致突变频率降低。研究建议将S9含量控制在10%即可获得可靠结果，这同时符合3R原则。在实际操作中，建议采用双浓度策略——使用10%和30%两种S9浓度分别进行测试，以兼顾灵敏度与细胞毒性控制。[1]

四、阳性对照的浓度范围与溶剂选择

4.1 推荐浓度范围

根据现有研究数据，亚硝胺类阳性对照在Ames试验中的推荐浓度范围如下（详见表3），具体浓度需根据实验室历史数据和方法验证结果进行微调[5] 。

（表3：亚硝胺类阳性对照在Ames试验中的推荐浓度范围）

4.2 溶剂选择

溶剂的选择对试验结果有显著影响（详见表4），研究表明[5] ，N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）和乙酸乙酯等溶剂即使在较低剂量下也会抑制S9酶的活性。相比之下，二甲基亚砜（DMSO）在高达1.6%（v/v）的浓度下仍表现出良好的兼容性，且溶解能力强、细胞毒性低，因此被推荐为亚硝胺EAT的推荐溶剂。水也被证明是兼容的溶剂。 

（表4：亚硝胺类阳性对照在Ames试验中的推荐溶剂与注意事项）

4.3 纯度要求

为避免假阳性结果，所用阳性对照化合物应通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）确认高纯度（>98%）。此外，研究中还可采用谷胱甘肽共孵育策略，以淬灭过量的烷化剂，确保检测到的是真实的致突变信号而非非特异性烷化作用。

五、阳性对照在加强Ames试验中的质量控制作用

加强Ames试验与传统Ames试验在试验设计上存在多个关键差异[6][8] （详见表5） ：

（表5：传统Ames试验与加强Ames试验（针对亚硝胺）的关键参数）

阳性对照在加强Ames试验中承担着以下关键质量控制功能[2] （详见表6）：

（表5：传统Ames试验与加强Ames试验（针对亚硝胺）的关键参数）

六、实操建议与常见问题

Q1：如何确认阳性对照试验结果是有效的？

阳性对照组的回复突变菌落数应达到阴性对照组的3倍以上，且该效应应在多个剂量点呈现剂量-反应关系。同时，应建立实验室内部的历史数据范围（均值±2SD），用于日常结果判定。

Q2：如果NDMA和NDEA的响应信号都很弱，可能是什么原因？

可能原因包括：（1）S9混合液中仓鼠S9浓度不足或批次活性较低；（2）预孵育时间不足（应确保30分钟）；（3）溶剂对S9酶活性产生抑制；（4）阳性对照溶液配制有误或已降解。建议首先使用10%和30%仓鼠S9进行平行测试以排查S9相关因素。

Q3：对于NDSRI类杂质，如何选择合适的阳性对照？

对于NDSRI类杂质，EMA建议基于待测NDSRI的预期代谢特征来选择阳性对照。如果缺乏直接匹配的阳性对照，可以组合使用NDMA/NDEA作为基础阳性对照，同时选用一个结构相似、已知具有致突变活性的NDSRI作为补充阳性对照。

Q4：阳性对照的批次间差异如何处理？

建议每批新的阳性对照溶液与历史批次进行平行测试，确保响应强度在历史数据范围内。阳性对照应分装保存，避免反复冻融导致降解。

七、齐氏生物配套解决方案

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结语

在加强Ames试验中，亚硝胺类阳性对照的选择并非简单的“拿来主义"。科学、合理的阳性对照选择策略，是确保S9代谢活化系统有效性验证准确性的基石，也是满足EMA、ICH M7(R2)等监管要求的关键环节。

NDMA和NDEA作为经典的短链烷基亚硝胺阳性对照，是开展亚硝胺类杂质遗传毒性评估的基础选项；NDPA和NDBA可作为扩展选择，提供更广泛的代谢覆盖。结合30%仓鼠肝S9、30分钟预孵育以及TA1535/WP2 uvrA(pKM101)敏感菌株组合，可以较大化加强Ames试验的检测灵敏度。

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参考文献

[1] Dieckhoff J, Bringezu F, Simon S. Metabolic activation of short-chain alkyl N-nitrosamines using Aroclor 1254 or phenobarbital/beta-naphthoflavone-induced rat or hamster S9 – A comparative analysis[J]. Toxicology Reports, 2024, 12: 215-223.

[2] Bringezu F, Simon S. Salmonella typhimurium TA100 and TA1535 and Escherichia coli WP2 uvrA are highly sensitive to detect the mutagenicity of short alkyl-N-nitrosamines in the bacterial reverse mutation test[J]. Toxicology Reports, 2022, 9: 250-255.

[3] Shukla RM, Valani DT, Kajavadara CK, et al. Comparative analysis of TA102 and WP2 uvrA(pKM101) strains in detecting nitrosamine mutagens in the enhanced Ames test[J]. Environmental and Molecular Mutagenesis, 2025, 66(5): 291-297.

[4] Bercu J, et al. HESI GTTC ring trial: Concordance between Ames and rodent carcinogenicity outcomes for N-nitrosamines (NAs) with rat and hamster metabolic conditions[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2025, 161: 105835.

[5] Kajavadara CK, Patel SN, Shukla RM, et al. Selection of solvent and positive control concentration for enhanced Ames test conditions for N-nitrosamine compounds[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2024, 152: 105711.

Kajavadara CK, Valani DT, Patel SN, et al. Strain-specific mutagenicity of NDMA and CPNP: insights from TA1535, TA100, and WP2 uvrA(pKM101) under metabolic activation[J]. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2025, 117: 104752.

[7] European Medicines Agency. Enhanced Ames test conditions for N-nitrosamines; Appendix 3 to Questions and answers for marketing authorisation holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5(3) of Regulation (EC) No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal products (EMA/120337/2024)[S]. 2024.

[8] OECD. Test No. 471: Bacterial Reverse Mutation Test (Ames test)[S]. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris, 2020.

本期是「代谢π析·仓鼠S9专题」的第2篇，系统梳理了加强Ames试验中NDMA、NDEA等小分子亚硝胺阳性对照的选择策略。下一期我们将继续深入探讨一类更复杂的亚硝胺杂质——NDSRI（原料药相关亚硝胺杂质），欢迎持续关注！