及时解决小鼠肝微粒体常见问题是保障体外代谢研究质量的核心

更新时间：2026-02-26

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　　小鼠肝微粒体作为体外药物代谢研究的关键工具，广泛应用于药代动力学、毒性筛选及酶抑制评估等领域。其活性高度依赖制备质量、储存条件与实验操作规范。若处理不当，易出现代谢活性低、数据重复性差、非特异性结合高等问题，严重影响实验结论可靠性。科学识别并精准应对小鼠肝微粒体出现的常见问题，是保障体外代谢研究质量的核心。

　　一、代谢反应速率过低或无转化

　　原因分析：微粒体失活、NADPH再生系统失效、冻融次数过多或蛋白浓度不足。

　　解决方法：

　　严格冷链管理：微粒体应于–80℃保存，避免反复冻融（建议分装使用）；

　　验证NADPH再生系统新鲜配制（葡萄糖-6-磷酸、G6PDH等组分未降解）；

　　用阳性对照底物（如睾酮测CYP3A11、非那西丁测CYP1A2）验证批次活性；

　　测定微粒体蛋白浓度（Bradford法），确保反应体系中蛋白量一致（通常0.1–1mg/mL）。

　　二、实验重复性差（CV>15%）

　　原因分析：加样误差、孵育时间/温度不均、微粒体混悬不匀或酶抑制剂残留。

　　解决方法：

　　使用多通道移液器或自动化工作站减少人为误差；

　　孵育过程使用恒温振荡水浴（37℃±0.5℃），确保反应管受热均匀；

　　使用前将微粒体冰上超声5–10秒（低功率），形成均一悬液；

　　实验器皿清洗，避免洗涤剂或有机溶剂残留抑制酶活。

　　三、非特异性结合严重，回收率偏低

　　原因分析：化合物吸附于管壁或微粒体蛋白，尤其高脂溶性（logP>3）分子易损失。

　　解决方法：

　　使用低吸附耗材（如硅化玻璃管或聚丙烯低结合管）；

　　在反应体系中加入0.1%–0.5%BSA（牛血清白蛋白）竞争结合位点；

　　设置“零时间点”和“无NADPH”对照，校正非代谢损失；

　　优化终止方法（如乙腈沉淀蛋白后立即离心），减少吸附时间。

　　四、背景干扰或假阳性信号

　　原因分析：溶剂浓度过高（如DMSO>1%）、杂质干扰LC-MS检测或内源性物质干扰。

　　解决方法：

　　控制终体系DMSO≤0.5%，并设溶剂对照组；

　　使用高纯度试剂，避免辅料含荧光或离子化干扰物；

　　采用同位素内标法（SIL-IS）校正基质效应；

　　必要时进行空白微粒体+底物对照，排除非酶促降解。